Prezentare distinsă cu “Premiul pentru cea mai valoroasă lucrare de virusologie” în cadrul celui de-al V-lea Simpozion “Academician Nicolae Cajal”
Norica Nichita, Institutul de Biochimie al Academiei Române
Conform Organizaţiei Mondiale a Sănătăţii, aproximativ 400 milioane de persoane sunt astăzi infectate cu virusul hepatitei B (HBV), cu toate că există un vaccin eficient disponibil. Infecţia cu acest virus are consecinţe dintre cele mai grave, determinând apariţia fibrozei hepatice, a cirozei şi a carcinomului hepatic şi, în final, moartea a 600 000 de pacienţi în fiecare an, în întreaga lume. >>>
Curriculum Vitae
• Cercetător Ştiinţific gradul II, Şef Departament ‘Glicoproteine virale’, Institutul de Biochimie, Bucureşti
2000 – Doctorat in Biochimie
1993 – Facultatea de Biochimie Bucureşti, şef de promoţie
Domenii de interes :
Tehnologia ADN recombinant ; proteine eucariote si virale: biosinteză, glicozilare, pliere, degradare, trafic intracelular, secreție, prezentare antigen; morfologie virală; screening de compuși cu activitate antivirală.
Premii, burse și granturi internaționale:
2004 – Premiul «Emanoil Teodorescu» al Academiei Române
2004-2007 – Collaborative Research Initiative Grant, Wellcome Trust: “Mechanism of antiviral activity of iminosugar derivatives against Hepatitis B virus”, colaborare cu Univ. Oxford, director de grant
2004-2005 United Therapeutics Grant: “Screening of antiviral drugs using BVDV as a model for HCV”, colaborare cu Univ. Oxford
2001-2004 – International Research Development Award, Wellcome Trust: “Effect of a-glucosidase inhibitors on the morphogenesis of enveloped viruses”, colaborare cu Univ. Oxford, director de grant
NATO/Royal Society Postdoctoral Fellowship, Univ. Oxford
1996 – PECO Fellowship, Lille, Franța;
1995 – PICS Fellowship, CNRS Grenoble, Franța (3 luni);
1993-1994 – TEMPUS Fellowship, Universitatea Leuven, Belgia
Granturi naționale:
2001-2009 – 11 (director de proiect -4, colaborator -7).
Publicaţii:
Factor impact cumulat ~ 80. Total citări 370 . Indice Hirsh 11 (conform Scopus, http://www.scopus.com).
D
eşi replicarea acestui virus este descifrată la nivel molecular, aceasta fiind şi principala ţintă în tratamentul antiviral, etapele timpurii ale ciclului viral, cuprinzând ataşarea virusului de celula gazdă, interacţia cu receptorii specifici, internalizarea şi traficul intracelular al virionilor au rămas obscure. Această lipsă de date experimentale se explică prin absenţa unui model robust de infectivitate in vitro, în culturi celulare, hepatocitele primare umane fiind, până recent, singurele celule permisive infecţiei cu HBV. Aceste celule sunt însă greu de obţinut (rezecţiile hepatice fiind principala sursă), se dediferenţiază rapid în condiţiile specifice cultivării in vitro, iar eficienţa infecţiei cu HBV este redusă, ceea ce face ca rezultatele obţinute să fie nereproductibile şi greu de interpretat.
Obţinerea recentă şi caracterizarea liniei celulare de hepatom uman HepaRG, proliferativă şi permisivă infecţiei cu HBV în urma unui proces complex de diferenţiere, a deschis însă noi perspective pentru analiza internalizării HBV în celula gazdă, la nivel molecular.
În general, virusurile anvelopate pătrund în celulă prin endocitoza mediată de receptor, care poate avea loc pe mai multe căi, în funcţie de proteinele celulae structurale care formează învelişul veziculelor endocitate. Astfel, internalizarea prin caveolae are loc la nivelul regiunilor membranei plasmatice bogate în colesterol (“lipid rafts”), este un proces lent (minute-ore) şi depinde de asamblarea caveolinei‑1 (Cav-1), dar nu de pH; internalizarea mediată de clatrină depinde de asocierea acestei proteine la nivelul veziculelor endocitare, are loc doar la pH acid şi este foarte rapidă (milisecunde). Ambele căi sunt controlate de dinamina-2 (Dyn-2), o proteină cu activitate GTP-azică, importantă în strangularea mecanică a veziculelor endocitare în timpul internalizării ligandului. Virusurile mai pot fi internalizate şi pe căi independente de Cav-1 şi clatrină, sau prin micropinocitoză, dar aceste căi sunt mai puţin studiate, iar exemplele raportate sunt destul de rare.
Identificarea căilor de internalizare folosite de virusuri
Există mai multe abordări experimentale pentru identificarea căilor de internalizare folosite de virusuri. O opţiune simplă constă în tratarea celulelor cu inhibitori chimici. De exemplu, clorpromazina inhibă asamblarea clatrinei, iar compuşii cu rol alcalinizator (bafilomicina A, clorura de amoniu) blochează traficul post-internalizare caracteristic acestei căi. Internalizarea prin caveolae este inhibată de genisteină, care interferă cu căile de semnalizare cu rol în funcţia Cav-1, dar şi de compuşi chimici care inhibă sinteza de colesterol (statine) sau îl extrag din membranele celulare (ciclodextrine).
O altă modalitate, mai complexă şi mai specifică, se referă la silenţierea la nivel transcripţional a expresiei proteinelor structurale implicate într-o cale sau alta, sau la co-expresia de variante mutante, care competiţionează cu proteinele endogene, de tip sălbatic, pentru o anumită funcţie (dominanta negativă). În acest caz, secvenţa de ADN care codifică proteinele luate în studiu este modificată şi introdusă în celule prin procedee specifice de transfecţie. În proiectul finalizat cu lucrarea prezentată la conferinţă, pentru stabilirea căii de internalizare a HBV şi a proteinelor celulare implicate au fost folosite ambele metode descrise mai sus. Deoarece celulele HepaRG diferenţiate nu mai pot fi modificate genetic, secevenţele de ADN corespunzătoare proteinelor mutante Cav-1 şi Dyn-2 au fost introduse în linia proliferativă, prin transducţie, folosind vectori retrovirali, în urma selecţiei clonale rezultând patru noi linii celulare. Acestea au fost caracterizate din punct de vedere al nivelului expresiei proteinelor mutante, al stabilităţii acestora pe parcursul procesului de diferenţiere celulară şi al capacităţii de a endocita anumiţi liganzi-markeri specifici pentru internalizarea mediată de clatrină sau caveolină. Prin teste cantitative specifice s-a analizat, de asemenea, susceptibilitatea noilor linii celulare obţinute la infecţia cu HBV. Datele experimentale obţinute au demonstrat, în premieră, rolul esenţial al proteinelor celulare Cav-1 şi Dyn-2 în infecţia cu HBV şi implicarea zonelor bogate în colesterol de la nivelul membranei plasmatice în acest proces. Aceste rezultate deschid noi căi de investigare a unor compuşi cu posibilă activitate antivirală care acţionează la nivelul traficului intracelular, post-internalizare mediată de caveolae, cum este, de exemplu, genisteina.
Lucrarea prezentată a fost publicată în prestigiosul jurnal al Societăţii Americane de Microbiologie (ASM), Journal of Virology: “Hepatitis B virus requires intact caveolin-1 function for productive infection in HepaRG cells”. Macovei A, Radulescu C, Lazar C, Petrescu S, Durantel D, Dwek RA, Zitzmann N and Nichita NB (corresponding author) J Virol. 2010 Jan;84(1):243-253. <<<
