Asocierea conduct nervos și celule stem mezenchimale – metodă alternativă în regenerarea nervoasă periferică

0

Prof. dr. Ioan Petre Florescu, Departamentul de Chirurgie Plastică şi Reconstructivă, UMF Carol Davila

Conf. dr. Silviu Marinescu, Departamentul de Chirurgie Plastică şi Reconstructivă, UMF Carol Davila

Prof. Otilia Zărnescu, Departamentul de Histologie, Facultatea de Biologie, Univ. Bucureşti

Cercetător ştiinţific Ruxandra Mihai, Departamentul de Chirurgie Plastică şi Reconstructivă, UMF Carol Davila

 

I. INTRODUCERE.

Leziunile nervilor periferici sunt o continuă provocare pentru chirurgul plastician atât datorită numărului lor mare, cât și a faptului că reprezintă o sursă majoră de dizabilități. Wilson și Mackinnon1 descriu mai multe strategii de reparare, respectiv:

1. Grefe nervoase autogene

2. Transferuri nervoase

3. Conducte nervoase

4. Alogrefe nervoase.

Pentru restabilirea continuității nervoase în cazul defectelor nervoase „gold standard” sunt recomandate autogrefele. Alternativa grefării nervoase este reprezentată de tubulizare. Tubulizarea a fost studiată intensiv în cursul ultimilor ani, obținându-se o serie de conducte biologice sau sintetice viabile. Speranța îmbunătățirii rezultatelor prin utilizarea unor conducte nervoase artificiale a condus la multiple studii în domeniul regenerării nervoase periferice2.Deși conductele nervoase artificiale sunt evaluate, în principal, pe modele animale, cel mai rentabil fiind șobolanul, totuși ele au fost testate experimental și în condiții clinice3,4. Defectele nervoase au fost reparate prin simpla tubulizare sau prin asocierea cu factori neurotrofici specifici, respectiv cu nerve growth factor (NGF)5, brain derived neurotrophic factor (BDNF)6 și glial derived nerve growth factor (GDN F)7.

De asemenea, în scopul îmbu­nătă­țirii performanțelor biomaterialelor utilizate la obținerea conductelor nervoase, s-a testat și efectul includerii în acestea a celulelor Schwann sau a altor tipuri de celule. Mahay D et al susțin că, deși celulele Schwann sunt celule esențiale în regenerarea nervoasă periferică, prin suport fizic și ghidaj, ele nu sunt ideale pentru utilizarea în ingineria tisulară, deoarece au o creștere lentă in vitro. Alternativa este reprezentată de MSC diferențiate care demonstrează caracteristici celulare și moleculare similare celulelor Schwann8.

În studiul nostru pe un model animal (șobolan) de regenerare nervoasă periferică am investigat rolul MSC autologe în asociere cu conducte nervoase (CN), constituite din colagen: alcool polivinilic (PVA) într‑un raport de 1:1. La 12 săptămâni, șobolanii au fost investigați atât prin analize funcționale, cât și biochimice și imunohistochimice.

 

II. MATERIAL ȘI METODĂ

II.1. Obținerea CN din amestecuri condiționate de polimeri sintetici și naturali

A fost preparată o soluție de 10% a alcoolului polivinilic (PVA), care după o dizolvare completă a fost amestecată cu colagen. Ulterior a fost realizată reticularea membranelor obținute și testarea in vivo a conductelor nervoase pe șobolani Wistar, cărora li s-au implantat variantele de biomateriale. Cu o compoziție și formă finală stabilite, conductele nervoase  alese pentru testarea in vivo, pe animalul de laborator, au fost cele de PVAM – Colagen 1:1.

 

II.2. Izolarea și inițierea unei culturi de MSC din măduva osoasă de șobolan

Recoltarea MSC s-a realizat de la nivelul femurului, după sacrificarea animalelor, respectiv trei subiecți (femele) în vârstă de 7 săptămâni. Sacrificarea animalelor s-a făcut în conformitate cu normele etice internaționale privind tratamentul aplicat animalelor de laborator. Evaluarea și caracterizarea MSC și a plasticității lor s-a realizat prin analiza morfologiei celulelor, a capacității de formare a coloniilor CFU-F (fibroblast-colony forming units) și prezenței antigenelor de suprafață specifice celulelor stem mezenchimale (non-hematopoietice) (CDs). După evaluare MSC au fost supuse transdiferențierii prin cultivare în mediu de creștere, suplimentat cu un amestec de mediatori specifici.

Caracterizarea imunohistochimică a celulelor Schwann s-a realizat prin metoda de imunofluorescență indirectă.

 

II.3. Testarea in vivo

Animalele de laborator alese pentru testarea in vivo – șobolanii Wistar – au fost împărțite aleatoriu în trei grupe a câte 25 de subiecți: A) autogrefe, B) conducte nervoase și C) CN asociate cu MSC. Toate grupele au fost comparate cu sciaticul contralateral normal.

Fig.1. A) Grefa nervoasă,
B) Conduct nervos

 

II.4. Analizele funcționale

Analizele funcționale la 12 săptămâni au constat în teste senzitive (testul înțepării cu pensa (IP) și motorii (testul răsfirării degetelor). De asemenea, la 12 săptămâni, s-a stabilit indexul muscular gastrocnemian.

II.5. Examinarea histologică şi imunohistochimică

Secțiunile de 5 µm au fost colorate cu hematoxilina-eozina (H&E) şi vizionate la  un microscop Zeiss Axiostar Plus. Analizele imunohistochimice au vizat evaluarea regenerării nervului sciatic prin evidenţierea axonilor (proteina neurofilamentelor).

 

III. REZULTATE

III.1 Microscopia celulelor stem mezenchimale

Celulele stem mezenchimale obținute din măduva osoasă de șobolan au fost evaluate din punct de vedere al morfologiei prin microscopie optică și caracterizate prin citometrie în flux folosind markeri specifici.

Fig. 2. Cultura de celule stem din MO colorate cu Giemsa

 

III.2 Analiza de citometrie în flux

În urma imunofenotipării prin citometrie în flux, celulele s-au dovedit a fi pozitive pentru CD 73, CD 90 și CD 105 și nu au exprimat antigenele CD 34 și respectiv CD 45.

Fig. 3. Histograme pentru CD 73, CD 90 si CD 105

 

III.3 ANALIZE DE IMUNOHISTOCHIMIE

Înaintea incubării cu mediul de transdiferenţiere, celulele stem mezenchimale au prezentat o morfologie fuziformă sau stelată, cu un nucleu central. După transdiferenţiere celulele Schwann au adoptat o morfologie caracteristică.

  Fig. 4. Celule stem mezenchimale înainte de tratamentul de diferenţiere, negative pentru proteina S-100 (A). Celulele stem mezenchimale transdiferenţiate în celule Schwann, pozitive pentru proteína S-100 (B).

III.4. Analiza biochimică a polimerilor testați pentru regenerarea nervoasă

Combinarea alcoolului polivinilic cu colagenul nativ, în raport 1:1, reticulat, s-a dovedit candidatul cel mai bun pentru promovarea regenerării nervoase.

Fig. 5. Conduct nervos PVA:Col=1:1 (diametrul interior de 1.5 mm)

 

III.5 Rezultatele evaluării funcțio­nale

Animalele au fost urmărite timp de 12 săptămâni prin analiza comportamentului, măsurarea greutății, urmărirea eventualelor modificări tegumentare și ale părților moi.

Evaluarea funcțională a reparării nervoase s-a realizat prin analize clinice, testul abducției digitale, a înțepăturii (IP) și indexul muscular gastrocnemian. Animalelelor li s-a urmărit mersul, precum și postura.

 

III.5.1 Testarea senzitivă – înţeparea cu pensa (IP)

Între grupe nu au existat diferențe semnificative la 6 și la 12 săptămâni. Toate animalele au fost evaluate prin scorul maxim de 3 la 12 săptămâni.

 

III.5.2 Testarea motorie – abducţia digitală

Evaluarea testării motorii nu a relevat diferențe semnificative între grupuri pentru reperele de timp alese. Totuşi, se remarcă o creștere a răspunsului motor în grupul autogrefelor la 12 săptămâni, în timp ce la NC și NC cu MSC creșterea este minimală.

 

III.5.3 Indexul muscular
gastrocnemian

Reinervarea gastrocnemianului – măsurată așa cum am arătat anterior prin indexul muscular gastrocnemian (GMI) – nu a prezentat diferențe semnificative între cele 3 grupuri la 12 săptămâni. Cele mai bune rezultate s-au obținut în cazul autogrefelor, urmate de lotul de conducte cu MSC.

 

III.6 Rezultate analize electrono-microscopice şi imunohistochimice

 

Regenerarea nervului sciatic prin autogrefă 

Analizele histologice ale autogrefelor la 12 săptămâni au evidenţiat că fibrele nervoase mielinizate au fost mai mici în diametru şi teaca lor de mielină mai subţire, comparativ cu nervul sciatic normal. În autogrefe majoritatea fibrelor nervoase au regenerat în fasciculele originale.

 

Regenerarea nervului sciatic în prezenţa conductului nervos COL-PVA 

La toate animalele supuse experimentului nu s-a observat dizlocarea nervului din conductele nervoase. La 12 săptămâni de la fixarea conductului nervos, la toate animalele s-a observat formarea unei capsule conjunctive fibroase, subţiri, care a acoperit conductul nervos şi capetele proximal şi distal ale nervului sciatic secţionat.

Regenerarea nervului sciatic în prezenţa conductului nervos COL-PVA plin cu MSC

Spre deosebire de regenerarea în conductul nervos cu DMEM, regenerarea în conductul plin cu MSC a indicat regenerarea unui număr mai mare de fibre nervoase. Densitatea axonilor în nervii regeneraţi în prezenţa MSC a fost mai mare comparativ cu nervii regeneraţi în conductele cu DMEM. De asemenea, în aceste conducte zonele fără axoni au conţinut mai puţine celule non-neuronale de tipul fibroblastelor, macrofagelor sau celulelor inflamatorii (Fig. 6 A-B). Similar conductelor nervoase goale, şi în cazul conductelor nervoase cu MSC s-a constatat că nervul regenerat a avut un epineurium mai subţire (Fig. 6 A).

Fig. 6 A-B. Nerv sciatic regenerat în conduct nervos cu MSC. A-secţiune longitudinală; B-secţiune transversală. H&E.

 

Analize electrono-microscopice

Studiile electrono-microscopice au demonstrat prezenţa unor axoni simetrici înconjuraţi de o teacă de mielină.

Analizele electrono-microscopice comparative au evidenţiat că ultrastructura fibrelor nervoase regenerate în conductul plin cu MSC este asemănătoare cu cea din nervul sciatic normal.

 

IV. DISCUȚII

Datele prezentate în studiul nostru se referă la utilizarea unui nou tip de eșafodaj biocompozit bazat pe colagen și alcool polivinilic care a fost asociat sau nu cu celule stem mezenchimale pentru a acoperi un defect nervos de 10 mm în sciaticul de șobolan. Rezultatele funcționale și imunohistochimice au confirmat faptul că tuburile cu lumen unic utilizate de noi sunt o modalitate cu rezultate la fel de bune ca autogrefarea. Recuperarea senzitivă la 12 săptămâni a fost egală și maximă la toate cele trei loturi. Trebuie remarcat faptul că adăugarea de MSC a condus la o grosime mai mare a mielinei la lotul NC cu MSC comparativ cu NC cu DMEM și chiar cu autogrefele. De asemenea, grosimea fibrelor nervoase a fost mai mare la 12 săptămâni. Densitatea axonală a fost similară la toate cele trei grupe. Prin adăugarea MSC se speră să se poată repara defecte nervoase mai mari, întrucât la ora actuală aplicarea NC este limitată la defecte mai mici de 3 cm și la nervi senzitivi. Pe termen scurt, la 6 săptămâni, recuperarea motorie a fost mai bună în cazul tuburilor cu MSC decât în cazul autogrefării (scoruri ale testelor de abducție mai mari). Ca și în alte studii, (Maria Siemionow et al, 2011)9, explicația posibilă ar fi că tuburile nervoase se prezintă ca un lumen unic de diametru mai mare permițând creșterea rapidă a unui număr mai mare de axoni comparativ cu autogrefele care se comportă ca niște tuburi multicanaliculare.

În ciuda capacității de regenerare axonală spontană, recuperarea după leziuni traumatice ale sistemului nervos periferic este adesea incompletă și limitată la distanțe mici. Această situație se întâlnește în special în circumstanțele în care nervii sunt lezați la distanță de organele țintă și necesită reparare prin grefe autologe.

Pentru textul integral vezi editia print Medica Academica, Decembrie 2012.

About Author

Medica Academica

Leave A Reply